時は戦国。井伊家当主・井伊直盛には後を継ぐ男子がいなかったため、一人娘・おとわと分家の嫡男・亀之丞を婚約させ、亀之丞を次の当主にするつもりだった。ところが、井伊家を実質的に支配していていた今川家から謀反の疑いをかけられ、亀之丞の父が殺害されてしまう。亀之丞も命を狙われ逃亡し、行方知れずに。おとわは出家し、「次郎法師」として暮らすことになる。その後、亀之丞が帰還。元服して井伊直親となり、井伊家の将来は安泰かに見えた。しかし、度重なる戦で直盛をはじめ井伊の男子が次々と亡くなり、ついには直親も今川家の陰謀で命を落としてしまう。残された男子は直親の嫡男・虎松（後の井伊直政）のみ。この窮地を救うため、おとわは還俗して「井伊直虎」と名乗り、女城主として井伊家を支えていくのだった。
駿河の今川、甲斐の武田、三河の徳川と3つの大国が虎視眈々と領地をねらう中、資源も武力も乏しいこの土地で、頼るべきは己の知恵と勇気。仲間と力を合わせて国を治め、幼い世継ぎの命を守ってたくましく生き延びた直虎は、その後の井伊家が発展する礎を築いていく。そんな直虎の原動力となったのは、幼いころに約束を交わした許婚への一途な愛。愛を貫いて自らの運命を切り開き、戦国を生き抜いた女の激動の生涯とは……。

井伊谷で育った3人の幼なじみ、おとわ（井伊直虎）、亀之丞（井伊直親）、鶴丸（小野政次）。出家して次郎法師となったおとわは井伊を陰から支え、直親は井伊家の当主として、政次は今川家の目付役として、それぞれの立場から井伊家を支えていくはずだった。しかし、直親が命を落としたことで運命は大きく動き出す。
直親の意志を受け継ぎ、女城主となった直虎は、目まぐるしく勢力図が変わる戦乱の中で、後見人として直親の嫡男・虎松を育てながら、政次と協力して井伊の生き残る道を探ることに。だが、政次までもが直虎と井伊を守るために壮絶な最期を迎えてしまう。さらなる犠牲と戦を避けるため、井伊家の再興を諦めて穏やかな生活を求める直虎。そんな中、成長した虎松は、自らの手で井伊家の再興を成し遂げるべく、徳川家康のもとで万千代と名を変え出世を重ねていく。やがて直虎が没し、南渓和尚から「井伊の魂」を伝えられた万千代は、井伊の通字である「直」と小野の通字である「政」を合わせた「直政」の名を家康より賜り元服。3人の意志を受け継いだ直政は、家康のもとで天下太平の世を実現するのだった……。これは大切な人たちを守るため、多大な犠牲を払いながらも、戦のない世を求めて戦った者たちの、受け継がれていく意志の物語なのである。

SNSを中心に大きな盛り上がりを見せた本作は、その年に最もツイート数の多かったドラマ作品として「Twitterトレンド大賞エンタメコンテンツ・オブ・ザ・イヤードラマ部門」で第1位を獲得。さらに、未公開シーンも追加された総集編の放送終了後には、Twitterトレンド世界ランキング1位に「#おんな城主直虎」がランクインするという偉業を成し遂げた。
その立役者は何といっても、連続テレビ小説『ごちそうさん』やいま話題の『天国と地獄』などを手掛けた脚本家・森下佳子だろう。少女マンガ『ベルサイユのばら』と『甲賀忍法帖』『魔界転生』などの小説で知られる山田風太郎の作品を参考にしたというオリジナル脚本は、大河ドラマの新たな可能性を広げたとまで高く評価されている。井伊直虎はほとんど資料が残されていない人物だが、そうした数少ない史実をつなぎ合わせ、その隙間を想像力で拡大していく手腕、直虎たちを容赦なく追い詰めていく血なまぐさい展開と少女マンガのようなイケメンドラマを両立させるバランス感覚、所々にはりめぐらせた伏線など、その緻密な脚本は多くの視聴者を惹きつけた。また、史実では井伊家を裏切った奸臣とされる小野政次や、悪女として有名な築山殿（瀬名）といった人物が「実はこうだったのかもしれない」という新たな解釈で描かれており、史実を知る視聴者にも新鮮な驚きを与えたことも人気の理由のひとつだ。そんな森下が書いていて最も楽しかったエピソードというのが、最終回「石を継ぐ者」だったという。今まで描かれてきたすべての出来事が見事に集約される最終回を、ぜひその目で確かめてほしい。